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免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟

Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項(xiàng)技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.鋪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本次轉(zhuǎn)染的兩個(gè)蛋白分別帶有FLAG和HA標(biāo)簽。裂解細(xì)胞2.去除培養(yǎng)基，PBS吹下細(xì)胞，離心去上清。將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，PBS洗，離心去上清，加1ml裂解液。3.冰上孵育40min，每10min震蕩一次。4.超聲破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)和打斷染色質(zhì)。冰...

Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項(xiàng)

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，有許多常用的轉(zhuǎn)染試劑。下面簡單介紹下Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：Lipofectamine™3000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM（可以用無血清的培養(yǎng)基代替）實(shí)驗(yàn)步驟：1.接種細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70–90%匯合度。注：對于HEK293，6孔板一般鋪50萬個(gè)細(xì)胞左右。對于PC9,24孔板一般鋪5-10萬個(gè)細(xì)胞。由于不同細(xì)胞，生長狀況不太一樣，需要根據(jù)情況調(diào)整。2.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋Lipofectami...

啟動(dòng)子有哪些特征？

啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’-端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。基因的特異性轉(zhuǎn)錄取決于酶與啟動(dòng)子能否有效地形成二元復(fù)合物。那啟動(dòng)子有哪些特征？①序列特異性。在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框，序列框中堿基的變化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性的改變。②方向性。啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，有單向啟動(dòng)子和雙向啟動(dòng)子兩類。③位置特性。啟動(dòng)子一般位于所啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因的上游或基因內(nèi)的前端。處于基因的下游或在基因的上游但離...

PCR體系及各類常見PCR辨析

聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction)簡稱PCR，是一種體外高效擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)明人是KaryMullis，他從1983年開始研究PCR技術(shù)，1985年開始被逐漸采用，成為分子生物學(xué)的一項(xiàng)常規(guī)手段，并得到了廣泛的應(yīng)用，在臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義。PCR是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓需要擴(kuò)增的DNA片段變性解鏈成兩條單鏈，人工合成的一對引物讓它們結(jié)合到DNA模板（分別結(jié)合到兩條鏈上...

常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型

轉(zhuǎn)染，顧名思義，是指將某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要技術(shù)。在生物醫(yī)學(xué)研究中，這個(gè)“物質(zhì)”通常指的是DNA或RNA。通過轉(zhuǎn)染，我們可以向細(xì)胞引入新的基因，或者沉默或敲低細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因，從而進(jìn)行基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控，或是進(jìn)行基因治療等。在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇哪種細(xì)胞受體也有一定要求，本期我們就來了解一下常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型有哪些吧？常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括原代細(xì)胞、原代細(xì)胞衍生物、腫瘤細(xì)胞系、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、人胚腎細(xì)胞（HEK-293）、人...

PEI轉(zhuǎn)染試劑的作用原理及比較

目前，將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法大致可分為兩大類，即生物方法和物理化學(xué)方法。生物方法主要以病毒作為載體，通過病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。物理化學(xué)方法中常用的有磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔，以及最近出現(xiàn)的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術(shù)。其中常用的是化學(xué)方法，磷酸鈣、聚乙烯亞胺（PEI）、脂質(zhì)體等化學(xué)試劑較為常用，那么接下來著重探討一下PEI轉(zhuǎn)染試劑的作用原理及比較吧。PEI轉(zhuǎn)染試劑的作用原理使用廣...

怎樣培養(yǎng)造血干細(xì)胞呢？

造血干細(xì)胞(Hemopoieticstemcells,HSC)有高度的自我更新和多向分化潛能，可以產(chǎn)生所有成熟的血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞等，并且具有重建整個(gè)造血系統(tǒng)的潛能。可根據(jù)其來源將其分類為臍帶血造血干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞。在眾多研究和臨床應(yīng)用中，造血干細(xì)胞被廣泛用于治療急性白血病等血液系統(tǒng)疾病。由于其來源部位獲得不易，造血干細(xì)胞十分珍貴，所以其體外擴(kuò)增既要保持自我更新能力的同時(shí)還要阻止其分化。怎樣培養(yǎng)造血干細(xì)胞呢？近年來大量實(shí)驗(yàn)表明，...

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞你知多少？

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）是近年來干細(xì)胞研究和臨床治療領(lǐng)域的熱門課題，為再生醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展提供了新的機(jī)會(huì)，具有里程碑意義。那么關(guān)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞你知多少？什么是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞指由數(shù)個(gè)重編程基因?qū)肴梭w細(xì)胞逐步誘導(dǎo)獲得，不涉及倫理，且具備胚胎干細(xì)胞（ESCs）無限更新增殖和向所有細(xì)胞組織器官分化的能力，可以分化出這個(gè)人的血細(xì)胞，骨細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等，進(jìn)而培養(yǎng)出這個(gè)人的臟器，骨頭，眼角膜等。因此iPSCs又被稱為人造胚...