Lipo2000試劑的使用范圍較廣，它不僅可以用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、siRNA表達(dá)載體、雙鏈核糖核酸dsRNA轉(zhuǎn)染, 以及RNA等核酸轉(zhuǎn)染，還可以用于文庫(kù)篩選的高通量轉(zhuǎn)染。對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lipo 2000幾乎涵蓋了HEK293、CHO細(xì)胞、HeLa等190多種細(xì)胞系。本期內(nèi)容一起來(lái)學(xué)習(xí)下Lipofectamine™ 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)流程吧！

(一)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備:

因轉(zhuǎn)染效率依賴(lài)于細(xì)胞培養(yǎng)密度，而Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性，使用時(shí)需確保高細(xì)胞密度進(jìn)行，建議根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度提前種板并使用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)并達(dá)到80%-90%匯合，有助于獲得最高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平，且能最小化高轉(zhuǎn)染活性導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)降低影響。（可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞對(duì)試劑毒性的耐受程度調(diào)整細(xì)胞密度。）

(二)DNA準(zhǔn)備：

內(nèi)毒素是影響轉(zhuǎn)染效率高低的因素之一，請(qǐng)務(wù)必使用無(wú)內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得高純度的DNA，紫外可見(jiàn)光光度法測(cè)濃度并標(biāo)記計(jì)算用量。（質(zhì)粒純度：A260/A280 比值 (1.7-1.9)，越近 1.8 越好）

(三)轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：

血清會(huì)影響復(fù)合物的形成從而影響轉(zhuǎn)染效率，用無(wú)血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑。DNA和Lipo2000的比例，絕大多數(shù)細(xì)胞系通常推薦1:2-1:3，建議比例見(jiàn)下表。

表：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000與質(zhì)粒的用量參照表

對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品（以六孔板為例），按如下方步驟制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物:

1) Lipo2000稀釋液：取合適的EP管加入1500μl（250μl/孔） Opti-MEM，加入60μl（10μl/孔）Lipo2000混勻，室溫下靜置5分鐘。

2) DNA稀釋液：根據(jù)DNA的種類(lèi)不同，分別于EP管中加入250μl/孔Opti-MEM，再加入4μg/孔質(zhì)粒DNA輕輕混勻。

3) 將1)Lipo2000稀釋液以250μl/孔加入到2)各DNA稀釋液中，輕柔混勻，室溫靜置30min，形成DNA-Lipo2000復(fù)合物。

(四)轉(zhuǎn)染操作：

細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1小時(shí)左右更換新無(wú)雙抗無(wú)血清培養(yǎng)基。將制備好的DNA-Lipo2000復(fù)合物分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)板輕輕搖動(dòng)使復(fù)合物分布均勻。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，并在4-6h后更換wan全培養(yǎng)基。

(五)觀(guān)察：

如果轉(zhuǎn)染的是帶有熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒，可以在熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。

(六)注意事項(xiàng)：

1)Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑4℃保存，不可凍存。

2) Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。

3)有些無(wú)血清培養(yǎng)基(比如DMEM,CD293,SFMII,V-SFM等)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑時(shí)轉(zhuǎn)染效率有可能會(huì)降低。

4)Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不能渦旋、離心、暴力吹打，緩慢晃動(dòng)混勻即可。

5)用量?jī)H供參考，具體用量請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型、鋪板密度等其他實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

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